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企業(yè)展示抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性，兼具靶向精準(zhǔn)性和強(qiáng)效細(xì)胞殺傷力，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著潛力。ADC通常由三部分組成[1]：
靶向抗體：特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原；
細(xì)胞毒性載荷（Payload）：具有強(qiáng)效殺傷作用的小分子毒素；
連接子（Linker）：連接抗體與載荷，調(diào)控藥物釋放。
由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和多組分特性，ADC在體內(nèi)可經(jīng)歷脫偶聯(lián)、代謝轉(zhuǎn)化及降解等過程，產(chǎn)生多種存在形式，包括：完整ADC、總抗體（含裸抗體）、偶聯(lián)抗體（DAR ≥1）、游離Payload及其代謝物（如Payload-linker、Payload-linker-氨基酸復(fù)合物等）。全面表征各組分的體內(nèi)暴露特征（濃度、形式、動(dòng)態(tài)變化），對(duì)理解ADC的藥效、毒性及穩(wěn)定性至關(guān)重要。因此，建立穩(wěn)定、靈敏且多組分整合的生物分析方法，已成為ADC研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
圖1. ADC藥物的作用機(jī)理
一、ADC生物分析特點(diǎn)和方法選擇
2024年3月FDA發(fā)布“Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates Guidance for Industry”[2]指南，明確要求監(jiān)測：
游離Payload及其藥理活性代謝物；
完整ADC；
總抗體（含ADC與裸抗體）；
藥物-抗體比（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）。
ADC兼具小分子（Payload）和大分子（抗體）的雙重屬性，其生物分析需采用多平臺(tái)整合策略[3]。常用的分析方法包括配體結(jié)合分析（Ligand Binding Assay, LBA）、LC-MS/MS法、親和捕獲LC-MS/MS、以及親和捕獲LC-HRMS，具體選擇取決于分析物類型：
二、基于LC-MS平臺(tái)的ADC分析策略
可裂解連接子（如Val-Cit、Glu-Val-Lys）：
不可裂解連接子（如MC、SMCC）：
總抗體：采用抗IgG抗體捕獲所有抗體形式（DAR ≥0），酶解后檢測恒定區(qū)替代肽段（如Fc區(qū)肽段）。 偶聯(lián)抗體（ADC）：必須使用抗-Payload抗體進(jìn)行特異性捕獲，再酶解檢測替代肽段，以確保僅定量DAR ≥1的分子。
前處理：蛋白沉淀（PPT）、液液萃取（LLE）及固相萃取（SPE）法； 關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
需要較高的檢測靈敏度：由于ADC藥物給藥后小分子毒素的釋放量有限，通常需要較高的檢測靈敏度一般需要在pg/mL級(jí)別； 需要關(guān)注ADC或Payload相關(guān)成分對(duì)于游離小分子毒素檢測的干擾，在方法開發(fā)和驗(yàn)證過程中進(jìn)行考察； 防止樣本處理過程中ADC釋放額外Payload（冰上操作、加蛋白酶抑制劑、控pH）； 排除源內(nèi)裂解干擾，需要在方法開發(fā)時(shí)進(jìn)行考察并對(duì)液相條件進(jìn)行優(yōu)化。
免疫捕獲：通常采用通用型免疫捕獲試劑（如抗IgG抗體）進(jìn)行免疫捕獲； 洗脫富集：將載體進(jìn)行洗脫得到純化的ADC及抗體蛋白，可直接進(jìn)樣分析或經(jīng)過還原處理； HRMS分析：不同DAR值的抗體有不同的分子量，采用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測，可以獲得樣品中各成分的質(zhì)荷比； 去卷積分析：對(duì)HRMS檢測獲得的質(zhì)荷比，經(jīng)過軟件分析得到不同成分的去卷積質(zhì)譜； DAR值計(jì)算：根據(jù)不同DAR值組分的質(zhì)譜強(qiáng)度，歸一化計(jì)算其平均DAR值。
三、基于LC-MS平臺(tái)分析ADC的關(guān)鍵考量
連接子的類型（可裂解vs.不可裂解）； Payload偶聯(lián)位點(diǎn)（半胱氨酸vs.賴氨酸）； 是否有抗Payload抗體（決定能否用LBA）； Payload或Payload-linker是否為全新化學(xué)實(shí)體； 替代肽段的選擇：替代肽段需具備高特異性、高響應(yīng)、無修飾干擾，可通過生物信息學(xué)工具（如Skyline）篩選。
圖3. 基于LC-MS平臺(tái)進(jìn)行ADC藥物分析策略圖[4]
結(jié)語
隨著質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，LC-MS技術(shù)已成為ADC生物分析不可或缺的工具。有濟(jì)醫(yī)藥已建立完善的LC-MS平臺(tái)，成功完成多項(xiàng)ADC藥物的分析，涵蓋新型載荷、多樣化連接子及不同類型抗體，可為ADC全生命周期研發(fā)提供全方位技術(shù)服務(wù)。
